LRRC15+-Myofibroblasten bestimmen den Stroma-Sollwert zur Unterdrückung der Tumorimmunität

Jun 24, 2023

Nature Band 611, Seiten 148–154 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Jüngste Einzelzellstudien zu Krebs bei Mäusen und Menschen haben die Entstehung einer Myofibroblastenpopulation identifiziert, die speziell durch das stark eingeschränkte Leucin-reiche-Repeat-enthaltende Protein 15 (LRRC15)1,2,3 gekennzeichnet ist. Die molekularen Signale, die der Entwicklung von LRRC15+-Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) zugrunde liegen, und ihr direkter Einfluss auf die Antitumorimmunität sind jedoch nicht charakterisiert. Hier in Mausmodellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs liefern wir in vivo genetische Beweise dafür, dass die Signalübertragung des TGFβ-Rezeptors Typ 2 in gesunden Dermatopontin+-Universalfibroblasten für die Entwicklung krebsassoziierter LRRC15+-Myofibroblasten wesentlich ist. Diese Achse treibt auch in erster Linie die Diversität der Fibroblastenlinien bei Krebserkrankungen beim Menschen voran. Unter Verwendung neu entwickelter Knock-in-Mäuse mit Lrrc15-Diphtherietoxinrezeptor zur selektiven Depletion von LRRC15+-CAFs zeigen wir, dass die Depletion dieser Population den Gesamtgehalt an Tumorfibroblasten deutlich reduziert. Darüber hinaus wird die CAF-Zusammensetzung in Richtung universeller Fibroblasten neu kalibriert. Dadurch entfällt die direkte Unterdrückung tumorinfiltrierender CD8+-T-Zellen, um deren Effektorfunktion zu verbessern und die Tumorregression als Reaktion auf die Blockade des Anti-PDL1-Immun-Checkpoints zu verstärken. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass TGFβ-abhängige LRRC15+-CAFs den Tumor-Fibroblasten-Sollwert zur Förderung des Tumorwachstums bestimmen. Diese Zellen unterdrücken auch direkt die Funktion von CD8+-T-Zellen und schränken die Reaktionsfähigkeit auf Checkpoint-Blockaden ein. Die Entwicklung von Behandlungen, die den homöostatischen Fibroblasten-Sollwert wiederherstellen, indem sie die Population krankheitsfördernder LRRC15+-Myofibroblasten reduzieren, kann das Überleben des Patienten und das Ansprechen auf eine Immuntherapie verbessern.

CAFs spielen eine Schlüsselrolle bei der Gestaltung der Tumormikroumgebung (TME) und der Reaktion auf eine Krebsimmuntherapie4,5,6. Frühere Studien zu Genexpressionsdaten von Tumoren von Patienten, die Therapien mit Immun-Checkpoint-Blockade (ICB) erhalten haben, haben auf einen Zusammenhang zwischen der CAF-Häufigkeit und der mangelnden Reaktion auf die Immuntherapie geschlossen7,8. Therapeutika, die gezielt auf CAFs abzielen, können diese Resistenz mildern, bleiben jedoch aufgrund eines unvollständigen Verständnisses der CAF-Heterogenität und der Identifizierung klinisch relevanter Untergruppen begrenzt. Der Einsatz der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) hat die Auflösung der Stromazelllandschaft in gesunden und erkrankten Geweben erhöht. scRNA-seq-Analysen der CAF-Evolution beim duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) und Brustkrebs haben eine Dominanz aktivierter Myofibroblasten (sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen) identifiziert, die durch LRRC15 markiert sind (Ref. 1,2,3). Diese CAF-Population exprimiert eine Vielzahl von Genen, die mit der extrazellulären Matrix und der Immunsuppression assoziiert sind1,9,10. Klinisch war eine hohe Expression einer LRRC15+-CAF-Gensignatur in Massen-RNA-seq-Daten von Krebspatienten mit einer mangelnden Reaktion auf den Anti-Programmed Death Ligand 1 (PDL1) ICB1 verbunden. Es bleibt unklar, ob LRRC15+-CAFs dieser fehlenden Reaktion zugrunde liegen oder ob sie eine Anzeige tumorintrinsischer Merkmale darstellen, die die Assoziation vorantreiben. Es fehlt auch die In-vivo-Untermauerung der zellulären und molekularen Signale, die die Entwicklung von LRRC15+-Myofibroblasten fördern, und ihres direkten Einflusses auf die Antitumorimmunität.

Aktuelle scRNA-seq-Studien wurden in Silico-Vorhersagen verwendet, um die aktive TGFβ-Signalübertragung mit der Bildung von LRRC15+-Myofibroblasten während der Tumorentstehung in Verbindung zu bringen1,3. Separate Einzelzellatlasstudien haben ergeben, dass sich aktivierte Fibroblasten-Untergruppen in gestörten Geweben aus universellen Fibroblasten im gesamten Gewebe entwickeln10. Unser Ziel war es, eine genetische In-vivo-Verbindung zwischen diesen beiden Schlussfolgerungen herzustellen und schlug vor, dass die TGFβ-Signalübertragung in universellen Fibroblasten für die Bildung von LRRC15+-Myofibroblasten während der Tumorprogression unverzichtbar ist. Wir verwendeten ein Maussystem, das auf Dermatopontin (DPT) abzielt, ein extrazelluläres Matrixprotein, das universelle Fibroblasten markiert10. DptIresCreERT2-Mäuse wurden mit TGFβ-Rezeptor-Typ-2-Mäusen (TGFβR2, kodiert durch Tgfbr2) gekreuzt (DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl), um einen induzierbaren und bedingten Knockout von Tgfbr2 in DPT+-Universalfibroblasten zu erzeugen (Abb. 1a, oben). Dptwt/wtTgfbr2fl/fl-Mäuse (Kontrolle) oder Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Mäuse (Dpt-bedingter Knockout) wurden einer Tamoxifen-Therapie (TAM) unterzogen und ihnen wurde subkutan KPR3070 implantiert (KPR; KrasLSL.G12D/wt;p16/p19fl/wt; p53LSL.R270H/wt;Pdx1.Cre) PDAC-Tumorzellen1,11. Die Tumoren wurden 21 Tage nach der Implantation zur Durchflusszytometrieanalyse gesammelt (Abb. 1a, unten). Um ein effizientes Knockout von Tgfbr2 sicherzustellen, wurde das gleiche TAM-Regime (in Abb. 1a dargestellt) zunächst bei DptIresCreERT2Rosa26LSLYFP-Reportermäusen10 mit subkutanen KPR-Tumoren durchgeführt. Dies wurde durchgeführt, um zu verstehen, welcher Anteil der Tumorfibroblasten aus DPT+-Zellen stammt, einer Fibroblastenpopulation, die in naivem Hautgewebe häufig vorkommt10. Nach 21 Tagen der Implantation waren die meisten (rund 84 %) der PDPN+-Fibroblasten in Tumoren YFP+ (Erweiterte Daten, Abb. 1a). Im Gegenzug war die TGFβR2-Expression auf PDPN+ CAFs von Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Tumoren im Vergleich zu Dptwt/wtTgfbr2fl/fl-Tumoren um etwa 90 % reduziert (Extended Data, Abb. 1b). Infolgedessen wiesen Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Tumoren im Vergleich zu Dptwt/wtTgfbr2fl/fl-Kontrolltumoren eine signifikante Verringerung der Gesamtzahl der LRRC15+PDPN+-CAFs auf, was darauf hindeutet, dass LRRC15+-Zellen für ihre Bildung auf die TGFβR2-Signalübertragung in DPT+-Zellen angewiesen sind (Abb. 1b,c). Trotz der signifikanten Verringerung der LRRC15+-Zellen in Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Tumoren blieb die Gesamtzahl der PDPN+CD31–-Fibroblasten in beiden Gruppen unverändert, was darauf hindeutet, dass ein Kompensationsmechanismus zur Aufrechterhaltung des CAF-Kompartiments stattfand (Abb. 1d).

a, Schematische Darstellung des genetischen (oben) und experimentellen (unten) Ansatzes zur Erzeugung von DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl-Mäusen. sc, subkutan. b–g, Die Daten stammen von subkutanen KPR-Tumoren 21 Tage nach der Implantation in Dptwt/wtTgfbr2fl/fl- und Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Mäusen. b: Repräsentative Durchflusszytometriediagramme, die die Häufigkeit von PDPN+LRRC15+-Zellen zeigen. Die Zellen wurden auf PDPN+CD31–-Zellen gesteuert. c,d, Quantifizierung der Gesamtzahl der PDPN+LRRC15+-Zellen (c) und PDPN+CD31–-Zellen (d), normalisiert durch das Tumorgewicht (n = 12 Mäuse). e, UMAP-Diagramm (Uniform Manifold Approximation and Projection) von 6.525 einzelnen Fibroblasten, gefärbt nach Clusterzugehörigkeit (links, n = 5 Mäuse pro Gruppe) und der relativen durchschnittlichen Expression der angegebenen Markergene in Clustern (C0–C5) aus dem UMAP (rechts). ). f, UMAP wie in e, aufgeteilt nach Genotyp. g, UMAP wie in e, aufgeteilt nach Genotyp und gefärbt durch die Expression von Lrrc15. h–j, Daten stammen von orthotopen pankreatischen KPR-Tumoren 15 Tage nach der Implantation in Dptwt/wtTgfbr2fl/fl- oder Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Mäusen. h, repräsentative Durchflusszytometriediagramme, die die Häufigkeit von PDPN+LRRC15+-Zellen zeigen. Die Zellen wurden auf PDPN+CD31–-Zellen gesteuert. i,j, Quantifizierung der Gesamtzahl der PDPN+LRRC15+-Zellen (i) und PDPN+CD31–-Zellen (j), normalisiert durch das Tumorgewicht (n = 11 oder 14 Mäuse). k, Schema der Sammlung menschlicher Proben. NAT, normales angrenzendes Gewebe; BLAD, Blasen-Urothelkarzinom; GYN, gynäkologische Tumoren; PDAC, duktales Pankreas-Adenokarzinom; HNSC, Plattenepithelkarzinom im Kopf- und Halsbereich; SRC, Sarkom; KID, Nierenkrebs; HEP, hepatozelluläres Karzinom der Leber; CRC, Darmkrebs; LUNGE, Lungenkrebs; MEL, Melanom; UAW, Nebennierenkrebs; PNET, neuroendokriner Tumor der Bauchspeicheldrüse; GALLE, Gallenblasenkrebs. l, PCA von Stromazellproben. Formen geben den Ursprung der Probe an; Farben stellen die Krebsindikation dar. m, Genladungen für PC1 von l. n, Verteilung der Proben aus bestimmten Indikationen über PC1 von l. o, Pearson-Korrelationskoeffizient (PCC) zwischen der LRRC15-Expression und der Aktivität des TGFβ-Signalwegs in allen Proben (ausgefüllte Kreise). Lineare Regressionslinie (gestrichelte Linie). p, Walddiagramm, das die TGFβ-CAF-Gesamtüberlebensrisikoverhältnisse (HRs) für bestimmte TCGA-Indikationen darstellt. Die Daten in c, d, i und j sind der Mittelwert ± Standardabweichung. Die Daten in c, d, i und j werden aus zwei oder drei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Für n stellen Whiskers das Minimum und Maximum dar, das Kästchen stellt den Interquartilbereich dar und die Mittellinie stellt den Median dar. Für p zeigt der Mittelpunkt die HR, die Linien stellen das 95 %-Konfidenzintervall (CI) dar. Die Statistiken wurden mithilfe des zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests (c,d,i,j) oder des Cox-Proportional-Hazards-Regressionsmodells (p) berechnet.

Quelldaten

Die Aufrechterhaltung des Gesamtgehalts an Fibroblasten ohne Bildung von LRRC15+ CAF in Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Tumoren erforderte eine eingehendere Untersuchung der Fibroblastenzusammensetzung in diesen Mäusen. scRNA-seq wurde an CD24-CD45-Stromazellen und CD45+-Immunzellen sowohl von Dptwt/wtTgfbr2fl/fl- als auch Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Tumoren durchgeführt (Extended Data Abb. 1c). Nach Qualitätskontrolle, Dimensionsreduktion und Clustering vier Hauptgruppen Es wurden mehrere Zellen identifiziert, die jeweils durch Zellen mehrerer Tiere repräsentiert wurden (Extended Data Abb. 1d). Dabei handelte es sich um Immunzellen (Ptprc+, auch bekannt als Cd45+), Endothelzellen (Pecam1+, auch bekannt als Cd31+), Perizyten (Rgs5+) und Fibroblasten (Lum+) (Ergänzungstabelle 1). Die Konzentration unserer nachgelagerten Analyse auf Fibroblasten ergab sechs CAF-spezifische Cluster (Abb. 1e und Ergänzungstabelle 2): einen Pi16 + -Cluster, der universelle Fibroblastenmarker stark exprimierte (Cluster 3); ein Cxcl12+-Cluster (Cluster 2); ein Cluster von Crabp1+-CAFs (Cluster 1); ein Cluster, der Proliferationsmarker stark exprimierte (Cluster 4); und zwei Cluster mit hoher (Cluster 0) und niedriger (Cluster 5) Lrrc15-Expression (Abb. 1e). Die Cluster 0 und 5 exprimierten über Lrrc15 hinaus zusätzliche Myofibroblastenmarker, die auf die TGFβ-Signalübertragung hinweisen, wie z. B. Acta2 und Tagln. Diese beiden Cluster erzielten auch gute Ergebnisse für eine Tgfb-CAF-Gensignatur, die zuvor aus gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs) von PDAC1 abgeleitet wurde (Extended Data, Abb. 1e). Zur Bestätigung unserer Hypothese, dass die TGFβR2-Signalübertragung in DPT+-Zellen für die LRRC15+-CAF-Entwicklung erforderlich ist, fehlten in Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Mäusen beide Cluster 5 und 0 (Abb. 1f). Darüber hinaus hatten Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Tiere fast keine Zellen, die Lrrc15, Acta2 oder Tagln exprimierten (Abb. 1g und erweiterte Daten Abb. 1f). Das Fehlen von LRRC15+-CAFs führte zu einem gleichzeitigen Anstieg der relativen Häufigkeit des universellen Pi16+-Fibroblastenclusters 3 und des Crabp1+-Clusters 1 in Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Mäusen. Dieses Ergebnis bestätigt unsere Erkenntnisse, dass der Gesamtgehalt an Tumorfibroblasten kompensiert wird, wenn keine LRRC15 + CAF-Entwicklung vorliegt (Extended Data Abb. 1g, h). Es wurden keine signifikanten Veränderungen in der relativen Häufigkeit des proliferierenden Clusters 4 beobachtet, aber proliferierende Zellen von Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Mäusen erzielten niedrige Werte für die Tgfb-CAF-PDAC-GEMM-Signatur. Im Gegensatz dazu erzielten Zellen von Dptwt/wtTgfbr2fl/fl-Tieren hohe Werte für diese Signatur, was mit unserer Feststellung übereinstimmt, dass die LRRC15+-CAF-Bildung aus DPT+-Universalfibroblasten von TGFβR2 abhängt (Extended Data Abb. 1i).

Als nächstes fragten wir, ob die gleiche Signalwegaktivierung für die LRRC15+-CAF-Entwicklung in der Bauchspeicheldrüse erforderlich ist, einer Gewebestelle mit einer ähnlichen Häufigkeit von DPT+-Universalfibroblasten im Steady-State10. KPR-Tumorzellen wurden orthotopisch in die Bauchspeicheldrüse von Dptwt/wtTgfbr2fl/fl- oder Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Mäusen implantiert und die Tumoren 15 Tage später analysiert (Abb. 1a, unten). Ähnlich wie bei subkutanen KPR-Tumoren war die Entwicklung von LRRC15+PDPN+ CAFs in orthotopen Pankreastumoren bei Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Mäusen im Vergleich zu Kontroll-Dptwt/wtTgfbr2fl/fl-Mäusen signifikant beeinträchtigt, während die Gesamtzahl der PDPN+CD31–-Fibroblasten unverändert blieb (Abb . 1h–j).

Diese Daten liefern einen direkten In-vivo-Beweis dafür, dass die TGFβ-Signalübertragung für die Differenzierung von DPT+-Universalfibroblasten in LRRC15+-Myofibroblasten erforderlich ist. Die Abschwächung der LRRC15+-CAF-Entwicklung führte zu einer Akkumulation von DPT+-Universalfibroblasten und TGFβR2-unabhängigen CAFs, um das CAF-Kompartiment in ihrer Abwesenheit aufrechtzuerhalten. Wichtig ist, dass diese Abstammungsbeziehung und Signalabhängigkeit an mehreren Gewebestellen erforderlich war, was die universelle Natur von DPT+-Fibroblasten bestätigt.

Als nächstes wollten wir verstehen, ob die Achse zwischen universellen Fibroblasten und LRRC15+-Myofibroblasten repräsentativ für das Fibroblastenkompartiment bei Krebserkrankungen beim Menschen ist. Frühere Studien1 stützten sich auf die Entfaltung von Massen-RNA-Seq-Daten ganzer Tumorproben aus dem Krebsgenomatlas (TCGA), um auf die Häufigkeit einer bestimmten CAF-Untergruppe in allen Indikationen zu schließen. Um uns speziell auf die Heterogenität innerhalb des Fibroblastenkompartiments bei verschiedenen Krebsarten beim Menschen zu konzentrieren, haben wir CD45-CD44+CD90+-Stromazellen aus 159 Patientenproben nach 13 Indikationen sortiert (Abb. 1k und Ergänzungstabelle 3) und Massen-RNA-seq-Expressionsprofile erstellt. Das Filtern nach hochreinen Proben auf der Grundlage der Hauptkomponentenanalyse (PCA) und der hierarchischen Clusterbildung ermöglichte einen unvoreingenommenen Einblick in humane CAF-Expressionsprogramme und ihre Pan-Krebs-Prävalenz (Extended Data, Abb. 2a). Wir haben keine klare Trennung der Krebsindikationen im PCA-Bereich beobachtet, was darauf hindeutet, dass Pan-Krebs-Stromazellsignaturen die beiden ersten Hauptkomponenten (PCs) steuern (Abb. 1l). Zu den Genen mit den stärksten positiven Gewichten für PC1 gehörten bekannte LRRC15+-CAF-Expressionsmarkergene wie COL10A1, COL11A1, MMP11 und LRRC15 (Lit. 1). Umgekehrt hatten Marker, die mit zuvor beschriebenen universellen Fibroblasten wie CD34 und PI16 assoziiert sind, die stärksten negativen Gewichte für PC1 (Lit. 10) (Abb. 1m). Konsistent wiesen Proben aus normalem angrenzendem Gewebe überwiegend negative PC1-Werte auf (Erweiterte Daten, Abb. 2b). Unter den analysierten Indikationen wiesen Proben von Bauchspeicheldrüsenkrebs und Blasenkrebs die höchsten PC1-Werte auf, was auf eine starke Anreicherung von LRRC15+-CAFs hinwies (Abb. 1n). Der Trend hoher LRRC15+ CAF-Spiegel bei Bauchspeicheldrüsenkrebs wurde in einem unabhängigen Datensatz bestätigt (Extended Data Abb. 2c). Die Analyse der Signalweganreicherung ergab, dass Proben mit hoher LRRC15-Expression eine erhöhte Aktivierung des TGFβ-Signalwegs aufwiesen, was stark darauf hindeutet, dass das LRRC15+ CAF-Expressionsprogramm beim Menschen, wie genetisch in unserem Mausmodell gezeigt, in ähnlicher Weise durch die TGFβ-Signalisierung gesteuert wird (Abb. 1o). Hohe Expressionsniveaus von TGFβ-CAF-Markern waren signifikant mit einem schlechteren Überleben bei Proben aller Indikationen in TCGA und innerhalb bestimmter Tumortypen, einschließlich Blasenkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs, verbunden (Abb. 1p und erweiterte Daten, Abb. 2d). Diese Humandaten offenbaren eine zentrale Achse der CAF-Heterogenität bei menschlichen Krebsarten, die durch universelle Fibroblasten und LRRC15+-Myofibroblasten definiert wird, wobei die TGFβ-Signalisierung in Indikationen angereichert ist, in denen LRRC15+-CAFs reichlich vorhanden sind.

Zusammen mit den Ergebnissen unseres genetischen Maussystems legen diese Ergebnisse nahe, dass die TGFβ-Signalübertragung als Rheostat fungiert, um den Tumorfibroblasten-Sollwert zwischen universellen Fibroblasten und LRRC15+-Myofibroblasten zu bestimmen, und als potenzieller Prädiktor für das Patientenergebnis dienen kann.

Um den Einfluss von LRRC15+-CAFs auf das Tumorwachstum und die Anti-Tumor-Immunität zu untersuchen, wurde ein genetisches Mausmodell erstellt, bei dem eine Diphtherietoxinrezeptor (DTR)-GFP-Kassette in Exon 2 stromabwärts des Startcodons von Lrrc15 (Lrrc15DTRGFP knock-down) eingefügt wurde. in Mäusen). Dieses Modell ermöglichte die kontrollierte Depletion von LRRC15-exprimierenden Zellen nach der Verabreichung von Diphtherietoxin (DT) (Abb. 2a, oben). Um sicherzustellen, dass dieser Ansatz eine selektive Ablation dieser Subpopulation von CAFs ermöglicht, haben wir die LRRC15-Expression in Mäusen untersucht. Innerhalb von KPR-Tumoren war die LRRC15-Expression auf PDPN+-Fibroblasten beschränkt und fehlte in anderen Kompartimenten weitgehend (Extended Data, Abb. 3a). Außerhalb von Tumoren zeigten In-situ-Hybridisierung und Bulk-RNA-seq12-Analyse, dass die Lrrc15-Expression in mehreren Geweben gering bis nicht vorhanden war (Extended Data Abb. 3b, c). Ähnliche Ergebnisse wurden bei menschlichen Tumoren und peripheren Geweben berichtet13.

a, Schematische Darstellung des genetischen (oben) und experimentellen (unten) Ansatzes für Lrrc15DTRGFP-Mäuse. b–e, Die Daten stammen von subkutanen KPR-Tumoren 8 Tage nach der DT-Behandlung bei DTR–- und DTR+-Mäusen. b: Repräsentative Durchflusszytometriediagramme, die die Häufigkeit von PDPN+LRRC15+-Zellen zeigen. Die Zellen wurden auf CD24–CD45–-Zellen (links) oder PDPN+CD31–-Zellen (rechts) gesteuert. c,d, Quantifizierung der Gesamtzahl der PDPN+LRRC15+-Zellen (c) und PDPN+CD31–-Zellen (d), normalisiert durch das Tumorgewicht (n = 12 oder 14 Mäuse). e, Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von LRRC15 und DAPI. Maßstabsbalken, 250 µm. f, Tumorwachstumskurven von DTR–- und DTR+-Mäusen, die mit DT behandelt wurden (n = 9 oder 11 Mäuse pro Gruppe). Links: durchschnittliches Tumorvolumen aller Tiere (*P = 0,015, ***P = 0,0006, ****P < 0,0001). Mitte und rechts: Wachstumskurven einzelner Tiere pro Genotyp. Die x-Achse stellt die Tage nach der DT-Behandlung dar. Die gestrichelte rote Linie stellt die durchschnittliche Referenzanpassung für die Kontrollgruppe (Strg) dar. Die Daten in c und d werden aus vier unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Die Daten in e und f sind repräsentativ für zwei oder drei unabhängige Experimente. Die Daten in c, d und f sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Die Statistiken wurden mithilfe eines zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests (c und d) oder einer gewöhnlichen zweifachen Varianzanalyse (f) berechnet.

Quelldaten

Da bei früheren CAF-Depletionsstrategien Marker wie α-Glattmuskel-Aktin (αSMA, kodiert durch Acta2) und Fibroblastenaktivierungsprotein (FAP, kodiert durch Fap)14,15 verwendet wurden, verglichen wir die Expressionsniveaus von Fap und Acta2 mit Lrrc15. In KPR-Tumoren war die Expression von Lrrc15 auf Fibroblasten beschränkt, wohingegen die Expression von Acta2 und Fap sowohl in Fibroblasten als auch in Perizyten beobachtet wurde (Extended Data, Abb. 3d). Über den Tumor hinaus wurde die Expression von Fap und Acta2 in Stromazellen in mehreren Geweben beobachtet, wohingegen Lrrc15 fehlte (Erweiterte Daten, Abb. 3e). In hautdrainierenden Lymphknoten (LNs) von Mäusen wurde Acta2 stark von Perizyten exprimiert, und sowohl die Fap- als auch die Acta2-Expression überlappten deutlich mit Ccl19+ fibroblastischen retikulären Zellen. Im Gegensatz dazu war Lrrc15 in fibroblastischen retikulären LN-Zellen oder Perizyten nicht nachweisbar (Extended Data Abb. 3f). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass LRRC15 ein echter Marker für TGFβ-gesteuerte CAFs ist, der nicht mit anderen Zellen innerhalb und außerhalb von Tumoren überlappt.

Angesichts der Spezifität der Lrrc15-Expression untersuchten wir den Einfluss der selektiven Depletion von LRRC15+-CAFs auf das Tumorwachstum. KPR-Tumoren wurden subkutan in Lrrc15DTRGFPwt/wt (DTR–) oder Lrrc15DTRGFPwt/ki (DTR+) Mäuse implantiert, und die DT-Behandlung wurde in beiden Gruppen von Mäusen eingeleitet, als die Tumoren ein mittleres Volumen von 100–200 mm3 erreichten (etwa 10 Tage nach der Implantation). (Abb. 2a, unten). Acht Tage später wurden die Tumoren gesammelt und auf das Vorhandensein von LRRC15+-CAFs untersucht. Tumore von DT-behandelten DTR–-Mäusen wiesen eine vorherrschende Population von LRRC15+-CAFs auf, wohingegen die DT-Behandlung in DTR+-Tumoren zu einem Verlust von etwa 98 % der gesamten LRRC15+-Zellen führte (Abb. 2b, c). Wichtig ist, dass der Verlust von LRRC15+-CAFs in DTR+-Mäusen spezifisch für die DT-Behandlung war und nicht auf eine unzureichende Entwicklung dieser Zellen in Abwesenheit von DT zurückzuführen war (Extended Data Abb. 4a, b). Die Gesamtzahl der PDPN+-Fibroblasten war bei DT-behandelten DTR+-Mäusen ebenfalls signifikant um etwa 70 % reduziert (Abb. 2d). Die Immunfluoreszenzbildgebung bestätigte diese Ergebnisse und zeigte, dass bei DTR+-Tumoren keine LRRC15-Färbung vorlag (Abb. 2e). Die fortgesetzte DT-Verabreichung führte über den 8. Tag hinaus zu einer signifikanten LRRC15+-CAF-Depletion und einem verminderten PDPN+-Fibroblastenkompartiment und verursachte bei keiner der Mäusegruppen signifikante Veränderungen des Körpergewichts (Extended Data Abb. 4c, d). Infolgedessen wurde das Tumorwachstum nach anhaltender Erschöpfung der LRRC15+-CAFs bei DTR+-Mäusen im Vergleich zu DTR–-Kontrollmäusen deutlich verlangsamt (Abb. 2f). Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass die selektive Ablation des LRRC15+-Subtyps von CAFs in Tumoren zu einer signifikanten Verringerung des Gesamt-CAF-Gehalts und einer deutlichen und anhaltenden Verringerung der Tumorlast führt.

Der signifikante Einfluss der LRRC15+-CAF-Ablation auf das Fibroblastenkompartiment veranlasste uns, die Zusammensetzung der verbleibenden CAF-Umgebung in ihrer Abwesenheit zu untersuchen. scRNA-seq von CD24-CD45-Stromazellen aus Tumoren in DTR- und DTR+-Mäusen wurde zu 4 verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt, darunter 10 Tage nach der Tumorimplantation und unmittelbar vor Beginn der DT-Behandlung (IOT) (Tag 0) sowie an Tagen 7, 14 und 21 nach IOT (Abb. 3a und erweiterte Daten Abb. 5a, oben). Die DT-Behandlung wurde bei allen Mäusen vom Tag 0 bis zum Tag 14 eingeleitet und dann für die letzte Woche der Studie bis zum Tag 21 gestoppt (Abb. 3a). Zusätzlich wurden EPCAM-CD45-Stromazellen aus naivem, nicht tumortragendem Hautgewebe charakterisiert, um ein Basisprofil vor der Tumorimplantation zu erstellen (Abb. 3a und erweiterte Daten Abb. 5a, unten).

a, Versuchsschema (n = 5 Mäuse pro Zeitpunkt und Gruppe). b, UMAP-Diagramm von 37.383 einzelnen Fibroblasten, gefärbt nach Clusterzugehörigkeit (links) oder gefärbt nach Ursprungsgewebe (Mitte). Relative durchschnittliche Expression der angegebenen Markergene über Cluster hinweg vom linken UMAP (rechts). c, UMAP wie in b, gefärbt nach Ausdruck von Pi16 und Lrrc15 und aufgeteilt nach Zeitpunkt und Bedingung. d, Punktdiagramm zur Visualisierung des Prozentsatzes positiver Fibroblasten (Punktgröße) und der relativen durchschnittlichen Expression (Farbe) für Lrrc15 und Pi16 zu jedem Zeitpunkt und Zustand in tumortragenden Proben. e, Anteil der Zellen in Cluster 0 jeder Behandlungsgruppe (n = 5 Mäuse pro Gruppe) zu allen vier Zeitpunkten in tumortragenden Proben. f, PROGENy-Signalweganreicherungswerte (Farbe) für Zellen, die für jeden der angegebenen Zeitpunkte und Bedingungen gepoolt wurden (untere Reihe). Die Daten in e sind Mittelwert + Standardabweichung, und die Statistiken wurden mithilfe des zweiseitigen, ungepaarten Student-T-Tests berechnet.

Quelldaten

Nach der Qualitätskontrolle wurden 54.240 einzelne Stromazellen zu allen Zeitpunkten und Behandlungsgruppen analysiert. Dimensionsreduktion und Clusterbildung ergaben Perizyten (Rgs5+), Endothelzellen (Pecam1+, auch bekannt als Cd31+) und Fibroblasten (Lum+) als die drei wichtigsten Stromazellpopulationen (Erweiterte Daten, Abb. 5b, links und unten, und Ergänzungstabelle 4). Alle Cluster wurden mit Zellen mehrerer Tiere besiedelt, und nachfolgende Analysen konzentrierten sich auf Fibroblasten (Erweiterte Daten, Abb. 5b, rechts und Ergänzungstabelle 5). Fibroblasten aus naivem Hautgewebe bildeten zwei separate Cluster (Cluster 3 und 4) mit kaum oder gar keiner Beimischung von Zellen von tumortragenden Mäusen (Abb. 3b). Innerhalb des tumortragenden Gewebes konnten Fibroblasten vier Transkriptionsexpressionsphänotypen zugeordnet werden: einem Lrrc15-Cluster (Cluster 0), der auch Myofibroblastenmarker wie Tagln und Spp1 exprimierte; ein Cluster proliferierender CAFs (Cluster 5); ein Cluster von Cxcl14-exprimierenden CAFs (Cluster 2); und ein Cluster von Pi16high-CAFs (Cluster 1), die Expressionsmuster mit universellen Fibroblasten teilten (Abb. 3b).

Anschließend wurde die Fibroblastendynamik in DT-behandelten DTR–- und DTR+-Mäusen überwacht und die Expression von Pi16 und Lrrc15 zu jedem Zeitpunkt verglichen (Abb. 3c). In naiver, nicht tumortragender Haut fehlte die Lrrc15-Expression und alle Zellen waren einheitlich Pi16+. Dieses Ergebnis deutete auf einen universellen Fibroblasten-Phänotyp hin, der dem von normalen Pankreasgewebe-Fibroblasten ähnelte1,10. Im Tumorgewebe wurden am Tag 0 Pi16+-Zellen und Lrrc15+-Zellen nachgewiesen. Bei DTR–-Tieren stellten sich LRRC15+-CAFs im Laufe der Zeit als dominierende CAF-Population heraus, beginnend am 7. Tag und bestehen bis zum 21. Tag (Abb. 3c, d). Umgekehrt fehlten bei DTR+-Tieren Lrrc15+-Zellen während der ersten zwei Wochen der DT-Behandlung und es wurde ein gleichzeitiger relativer Anstieg der Pi16+-Zellen beobachtet, von denen eine Untergruppe auch Cxcl12 exprimierte (Abb. 3c, d und erweiterte Daten Abb. 5c). ). Am 21. Tag, eine Woche nach Beendigung der DT-Behandlung, traten Lrrc15+-Zellen wieder auf (Abb. 3c, d). Das gleiche Muster der Lrrc15-Kinetik spiegelte sich auf Clusterebene wider, wobei die Häufigkeit von Zellen aus LRRC15+ CAF-Cluster 0 zunahm und bei DTR–-Tieren beibehalten wurde. Im Gegensatz dazu wurden DTR+-Tieren vor dem Wiederauftauchen nach der DT-Entfernung Cluster-0-CAFs entzogen (Abb. 3e). Die relativen Häufigkeiten der tumorassoziierten Cluster 1, 2 und 5 waren bei DTR+-Tieren ebenfalls erhöht (Extended Data Abb. 5d). Die teilweise erhaltene Pi16-Expression durch CAFs der Cluster 1, 2 und 5 deutete darauf hin, dass sie sich in einem Zustand befinden, der normalen Gewebefibroblasten ähnlicher ist. Zur Untermauerung dieser Beobachtung erzielten die Cluster 1 und 2 höhere Werte für eine Signatur der normalen Hautfibroblasten der Cluster 3 und 4 als die Cluster 0 und 5 (Erweiterte Daten, Abb. 5e).

Die Aktivitätsanalyse des PROGENy-Signalwegs17 ergab eine hohe TGFβ-Aktivität in Proben, in denen LRRC15+-CAFs vorhanden waren. Im Gegensatz dazu waren Proben, in denen LRRC15 + CAFs abgereichert waren, Fibroblastenproben aus naiver Haut am ähnlichsten und an den Signalwegen JAK-STAT, NF-κB und TNF angereichert (Abb. 3f). Dies wurde größtenteils durch die oben erwähnten Veränderungen in der Clusterhäufigkeit erklärt, bei denen die Cluster 1 und 2 die JAK-STAT-, NF-κB- und TNF-Signalwege mit normalen Gewebefibroblasten (Cluster 3 und 4) teilten, verglichen mit Cluster 0, der die höchste TGFβ-Aktivität aufwies (Erweiterte Daten Abb. 5f). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Erschöpfung der LRRC15+-CAFs nicht nur den gesamten Fibroblastengehalt in KPR-Tumoren verringert, sondern auch den Sollwert der verbleibenden CAFs in Richtung eines universelleren fibroblastenähnlichen Zustands neu kalibriert.

Aktuelle Studien haben einen klinischen Zusammenhang zwischen der hohen Expression einer LRRC15+-CAF-Signatur und dem fehlenden Ansprechen auf eine Anti-PDL1-Behandlung bei mehreren Krebsarten festgestellt1,2. Es bleibt jedoch ungeprüft, ob LRRC15+-CAFs die direkte Ursache für diesen Zusammenhang sind. Wir schlugen vor, dass die T-Zell-Immunität und die ICB-Reaktionsfähigkeit durch das Fehlen von LRRC15+-CAFs beeinträchtigt würden, und testeten dies in unserem präklinischen Modell. Zunächst haben wir festgestellt, ob die verbesserte Tumorkontrolle, die nach der LRRC15+-CAF-Ablation beobachtet wird, von CD8+-T-Zellen abhängt. Zu diesem Zweck erhielten DTR–- und DTR+-Mäuse, die subkutane KPR-Tumoren trugen und mit DT behandelt wurden, auch einen CD8-depletierenden oder Isotyp-Kontrollantikörper. Das Tumorwachstum wurde im Verlauf der Behandlung überwacht (Abb. 4a). Mäuse, bei denen die LRRC15+-CAFs erschöpft waren, zeigten im Vergleich zu Mäusen mit ausreichend LRRC15+-CAFs eine deutlich geringere Tumorlast (Abb. 4b und erweiterte Daten, Abb. 6a). Die Abreicherung von CD8-T-Zellen kehrte diesen Effekt um, was darauf hindeutet, dass CD8+-T-Zellen eine Rolle bei der Reduzierung der Tumorlast in Abwesenheit von LRRC15+-CAFs spielen (Abb. 4b und erweiterte Daten, Abb. 6a).

a,b, Die Daten stammen von DTR–- und DTR+-Mäusen mit subkutanen KPR-Tumoren, die mit DT und einem CD8-depletierenden Antikörper behandelt wurden. a, Experimentelles Schema. b, Durchschnittliche Tumorwachstumskurven (n = 10 Mäuse pro Gruppe; *** P = 0,0002, **** P < 0,0001). c–e, Subkutane KPR-Tumoranalyse am Tag 12 nach der DT-Behandlung bei DTR–- und DTR+-Mäusen. c, Quantifizierung von CD8+ T-Zellen, normalisiert durch Tumorgewicht (n = 10 Mäuse). d, Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von TIM3, LAG3 und CD39 auf CD8+PD1+ T-Zellen (n = 5 Mäuse). e, Quantifizierung der Häufigkeit von TNF+- und IFNγ+-CD8+-T-Zellen (n = 10 Mäuse). f, Quantifizierung der Häufigkeit von TNF+ und IFNγ+ von Anti-CD3- und Anti-CD28-aktivierten CD8+-T-Zellen nach 72-stündiger Kultur allein oder mit sortierten CAFs (L15, LRRC15; n = 4 Proben). g–j, Die Daten stammen von DTR–- und DTR+-Mäusen mit subkutanen KPR-Tumoren, die mit DT und einem Anti-PDL1-Antikörper behandelt wurden. g, Experimentelles Schema. h, durchschnittliche Tumorwachstumskurven (n = 9 oder 10 Mäuse pro Gruppe; ****P < 0,0001). i,j, Subkutane KPR-Tumoranalyse 12 Tage nach der Behandlung, die die Quantifizierung der Häufigkeit von Granzym B+ CD8+ T-Zellen (n = 10 Mäuse) (i) und TNF+IFNγ+ Granzym B+ CD8+ T-Zellen (n = 10 Mäuse) (j) zeigt. . k–m, Die Daten stammen von DTR–- und DTR+-Mäusen mit orthotopen Pankreas-KPR-Tumoren, die mit DT und einem Anti-PDL1-Antikörper behandelt wurden. k, Experimentelles Schema. l, Durchschnittliche Tumorwachstumskurven (n = 7 Mäuse pro Gruppe). Die x-Achse stellt die Tage nach der Implantation dar. m, Tumorgewicht am Tag 24 nach der Implantation (n = 5 Mäuse). Die Daten in b–f, h–j, l und m sind der Mittelwert ± Standardabweichung. Die Daten in b, h, d und f sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente und l und m sind repräsentativ für ein unabhängiges Experiment. Die Daten in c, e, I und j stammen aus zwei unabhängigen Experimenten. Die Statistiken wurden mithilfe eines gewöhnlichen einfaktoriellen Varianzanalysetests (b,f,h–j,l,m) oder eines zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests (c,d,e) berechnet. Signifikanzwerte kennzeichnen die DTR+ +-Isotypgruppe in b und die DTR+ + Anti-PDL1-Gruppe in h im Vergleich zu den anderen drei Gruppen.

Quelldaten

Um die pharmakodynamischen Auswirkungen der LRRC15+-CAF-Depletion auf die T-Zell-Funktion zu verstehen, verwendeten wir Durchflusszytometrie, um das intratumorale CD8+-T-Zellkompartiment 12 Tage nach der CAF-Depletion zu charakterisieren. Es wurde kein Unterschied in der Gesamtzahl der intratumoralen CD8+-T-Zellen zwischen LRRC15+-CAF-ausreichenden und CAF-defizienten Tumoren beobachtet (Abb. 4c). In Abwesenheit von LRRC15+-CAFs zeigten PD1+CD8+-T-Zellen jedoch eine deutlich verringerte Oberflächenmarkerexpression von Molekülen, die mit T-Zell-Erschöpfung und -Funktionsstörung verbunden sind18,19, einschließlich TIM3, LAG3 und CD39 (Abb. 4d). Darüber hinaus beobachteten wir eine Verbesserung der CD8+-T-Zellfunktion, wie durch die erhöhte Expression von TNF und IFNγ gezeigt (Abb. 4e).

Die Immunfluoreszenzanalyse von KPR-Tumoren ergab einen signifikanten Anteil tumorinfiltrierender CD8+-T-Zellen in unmittelbarer Nähe zu LRRC15+-CAFs, was darauf hindeutet, dass direkte Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen auftraten (Extended Data Abb. 6b). Dies veranlasste uns zu der Frage, ob LRRC15+ CAFs das Effektor-T-Zellpotential direkt beeinflussen können. LRRC15+- und LRRC15–-CAFs aus DTR–-Tumoren oder PDPN+ LRRC15-abgereicherte CAFs aus DTR+-Tumoren wurden 12 Tage nach der DT-Behandlung sortiert. Diese wurden dann einzeln mit Milz-CD8+-T-Zellen in Gegenwart von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern co-kultiviert (Extended Data Abb. 6c,d). Drei Tage später wurden CD8+ T-Zellen erneut stimuliert und auf TNF- und IFNγ-Proteinexpression untersucht. Im Vergleich zu CD8+ T-Zellen allein war die TNF- und IFNγ-Expression in Gegenwart von LRRC15+-CAFs signifikant reduziert, wohingegen die T-Zellfunktion in Gegenwart von LRRC15–-CAFs oder den normalisierten LRRC15-depletierten CAFs unverändert blieb (Abb. 4f). Diese Ergebnisse belegen eine Rolle von LRRC15+-CAFs bei der Unterdrückung der intratumoralen CD8+-T-Zellfunktion und zeigen, dass LRRC15+-CAFs das Effektorpotenzial von CD8+-T-Zellen direkt begrenzen können.

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Depletion von FAP+-Myofibroblasten in Krebsmodellen die Anti-PDL1-Reaktionsfähigkeit verbessern kann20. Wir wollten testen, ob ähnliche Effekte nach der LRRC15+ CAF-Ablation beobachtet werden. DTR–- und DTR+-Mäuse, die subkutane KPR-Tumoren trugen und mit DT behandelt wurden, erhielten einen Anti-PDL1- oder einen Isotyp-Kontrollantikörper und das Tumorwachstum wurde bewertet (Abb. 4g). LRRC15+ CAF-ausreichende Mäuse zeigten eine gewisse Empfindlichkeit gegenüber der Anti-PDL1-Behandlung, was durch eine teilweise Verringerung der Tumorlast gezeigt wurde. Umgekehrt war das Ansprechen auf die Anti-PDL1-Behandlung bei Mäusen mit LRRC15+-CAF-Mangel deutlich verstärkt, was sich in der deutlicheren Verringerung der Tumorlast widerspiegelte. (Abb. 4h und erweiterte Daten Abb. 6e). Diese Kombinationseinstellung verbesserte nicht nur die Tumorkontrolle, sondern führte auch zu einem signifikanten Überlebensvorteil, gemessen an der Zeit bis zur Tumorprogression (Extended Data Abb. 6f). Die durchflusszytometrische Analyse des CD8+-T-Zellkompartiments 12 Tage nach der Anti-PDL1-Behandlung mit LRRC15+-CAF-Depletion ergab einen Anstieg ihres zytolytischen Potenzials, gemessen anhand der Granzym-B-Expression. Die Häufigkeit polyfunktioneller T-Zellen war ebenfalls erhöht, was sich in der Anzahl der TNF+IFNγ+Granzym-B+CD8+-T-Zellen widerspiegelt (Abb. 4i,j).

Als nächstes fragten wir, ob das Fehlen von LRRC15+-CAFs das Ansprechen auf eine Anti-PDL1-Behandlung bei in der Bauchspeicheldrüse gewachsenen KPR-Tumoren verbesserte. KPR-Tumorzellen wurden orthotopisch in die Bauchspeicheldrüse von DTR–- oder DTR+-Mäusen implantiert. Am Tag 7 nach der Implantation wurde mit der DT-Behandlung in Kombination mit einem Anti-PDL1-Antikörper oder einer Isotypkontrolle begonnen und die Tumorlast mittels Ultraschallbildgebung gemessen (Abb. 4k und erweiterte Daten Abb. 7a). Ähnlich wie bei subkutanen Tumoren verbesserte die Ablation von LRRC15+ CAFs bei orthotopen Pankreastumoren die Tumorkontrolle deutlich und wirkte synergetisch mit Anti-PDL1, um die Tumorlast weiter zu reduzieren (Abb. 4l und erweiterte Daten Abb. 7b). Am 24. Tag von mit Anti-PDL1 behandelten DTR+-Mäusen gesammelte Tumoren zeigten deutlich geringere Tumorgewichte als Kontrollmäuse, was die während der Behandlung beobachtete Tumorvolumenkinetik widerspiegelte (Abb. 4m). Darüber hinaus zeigten DTR+-Pankreastumoren, unabhängig davon, ob sie mit Anti-PDL1 oder Isotypkontrolle behandelt wurden, eine nahezu vollständige Ablation von LRRC15+-CAFs und eine signifikante Verringerung des gesamten PDPN+-Fibroblastenkompartiments (Extended Data Abb. 7c-e). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die therapeutische Depletion von LRRC15+ CAFs aus der Mikroumgebung des Pankreastumors zu einer deutlich verbesserten Reaktion auf die Anti-PDL1-ICB-Behandlung führt.

In dieser Studie lieferten wir direkte genetische Beweise dafür, dass die TGFβ-Signalübertragung in DPT+-Universalfibroblasten die Bildung von LRRC15+-Myofibroblasten während der Tumorentstehung fördert und eine zentrale Fibroblastenachse bei mehreren Krebsarten beim Menschen darstellt. Die selektive Abreicherung von LRRC15+-CAFs reduzierte den Gesamtgehalt an Fibroblasten deutlich und versetzte dieses Stromakompartiment in einen universellen fibroblastenähnlichen Zustand. Dies wiederum verbesserte die intratumorale CD8+-T-Zell-Effektorfunktion und verstärkte die Anti-PDL1-Reaktionsfähigkeit.

Die Nützlichkeit von LRRC15 als stark eingeschränkter Marker für diese Myofibroblasten-Untergruppe ermöglichte es uns, ihre Rolle bei der Gestaltung des TME direkt zu untersuchen, ohne Fibroblasten in anderen Geweben wie LNs zu stören, wo die Gewebearchitektur sowie die Vorbereitung und Funktion von T-Zellen durch die lokalen Fibroblasten geformt werden Netzwerk16,21. Analysen von LRRC15+-CAF-depletierten Tumoren ergaben, dass die universelle fibroblastenähnliche Aktivität angereichert war, aber ohne anhaltende Ablation können LRRC15+-Myofibroblasten das CAF-Kompartiment wieder auffüllen und wieder Fuß fassen. Diese Daten unterstreichen die „Push-and-Pull“-Beziehung, die LRRC15+-CAFs mit universellen Fibroblasten haben, um einen Tumor-Fibroblasten-Sollwert festzulegen, der letztendlich die Anti-Tumor-T-Zell-Immunität und die Wirksamkeit der ICB-Therapie unterdrückt. Aus immunologischer Sicht sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die Art der Beziehung zwischen CD8+-T-Zellen und LRRC15+-CAFs zu verstehen, die zu ihrer funktionellen Unterdrückung führt. Darüber hinaus wird es wichtig sein zu verstehen, ob LRRC15+-CAFs die ICB-Reaktionsfähigkeit bei verschiedenen Indikationen und Tumorimmunphänotypen gleichermaßen beeinflussen.

Therapeutisch werfen unsere Ergebnisse die Frage nach der optimalen Strategie zur Modulation der LRRC15+ CAF-Aktivität auf. Der Einsatz von TGFβ-Inhibitoren, die derzeit in mehreren klinischen Studien22 evaluiert werden, ist eine attraktive Therapieoption zur Beeinträchtigung der LRRC15+-CAF-Bildung. Die Entfernung des TGFβ-Signals in DPT+-Vorläufern ermöglichte jedoch einen Kompensationsmechanismus zur Aufrechterhaltung der Gesamtzahl der Fibroblasten. Im Gegensatz dazu verringerte die LRRC15+-CAF-Ablation die Zellularität der Fibroblasten im TME deutlich. Wenn die optimale Umgebung für eine wirksame Anti-Tumor-Immunantwort ein CAF-Kompartiment erfordert, das sowohl kleiner als auch frei von LRRC15+-CAFs ist, deuten unsere Daten stark darauf hin, dass der Abbau von LRRC15+-CAFs selbst eine attraktivere Therapiestrategie sein könnte, um robuste und dauerhafte Reaktionen auf Krebs zu erzeugen Immuntherapie. Darüber hinaus legt das Vorhandensein von LRRC15+-Myofibroblasten bei anderen, nicht-neoplastischen Erkrankungen, wie etwa idiopathischer Lungenfibrose und Colitis ulcerosa10, nahe, dass ein solcher therapeutischer Ansatz ausgeweitet werden könnte, um Patientenvorteile in anderen Krankheitsbereichen zu bieten.

DptIresCreERT2-Mäuse10 und Lrrc15DTRGFP-Mäuse wurden bei Genentech entworfen, erzeugt und gezüchtet. Tgfbr2fl/fl-Mäuse (012603) wurden vom Jackson Laboratory erhalten. Für alle Studien wurden alters- und geschlechtsgleiche Mäuse (6–12 Wochen alt) verwendet. Die Mäuse wurden gemäß den Richtlinien der US National Institutes of Health unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Die Stichprobengrößen für jede Studie sind in den Abbildungslegenden beschrieben. Alle Experimente wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee bei Genentech genehmigt wurden.

Homologe Rekombination und embryonale Stammzelltechnologie (ES) der Maus23,24,25 wurden verwendet, um einen genetisch veränderten Mausstamm mit eingebautem Lrrc15-DTR-GFP zu erzeugen. Ein Gen-Targeting-Vektor wurde mit einem 1.704 bp langen 5'-Homologiearm entsprechend GRCm38/mm10-Chromosom 16: 30.274.520–30.276.223 und einem 1.994 bp langen 3'-Homologiearm entsprechend Chromosom 16: 30.270.786–30.272.779 konstruiert. Die Löschung von Exon 2 nach ATG entspricht Chromosom 16: 30.272.780–30.274.516. DTR-EGFP-SV40-FRT-PGK-neo-FRT wurde unmittelbar nach ATG von Exon 2 eingefügt. Der endgültige Vektor wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt, linearisiert und zum Targeting von C2 (C57BL/6N) ES-Zellen unter Verwendung von Standardmethoden (G418+ und) verwendet Ganciclovir-Selektion)26 C57BL/6N C2 ES-Zellen27 wurden mit 20 µg linearisierter Targeting-Vektor-DNA elektroporiert und unter Arzneimittelselektion im Wesentlichen wie zuvor beschrieben28 kultiviert. Positive Klone wurden mittels Long-Range-PCR und anschließender Sequenzbestätigung identifiziert. Richtig gezielte ES-Zellen wurden einer Karyotypisierung unterzogen. Auf Euploide Gene ausgerichtete ES-Zellklone wurden mit Adeno-FLP behandelt, um PGK-Neomycin zu entfernen, und ES-Zellklone wurden getestet, um Klone ohne Kopien der PGK-Neomycin-Kassette zu identifizieren, und die korrekte Sequenz des Zielallels wurde überprüft. Das Vorhandensein des Y-Chromosoms wurde vor der Mikroinjektion in Albino-Bl/6N-Embryonen überprüft. Eine Keimbahnübertragung wurde nach Kreuzung der resultierenden Chimären mit C57BL/6N-Weibchen erreicht. Genomische DNA von Jungtieren wurde mittels Langstrecken-PCR gescreent, um die gewünschte Genstruktur vor der Ausbreitung der Mauskolonie zu verifizieren. Für die Genotypisierung wurden die folgenden Primer verwendet: 5'-AGGCGAGGCGATTG-3', 5'-CGATGAGGGCTGAAATGT-3' und 5'-TGGTCCGTGGATACAGT-3' amplifizierte 408-bp-Wildtyp- und 313-bp-Knock-in-DNA-Fragmente. Der folgende PCR-Zyklus wurde verwendet: 94 °C für 4 Minuten, (94 °C für 1 Minute, 55 °C für 30 Sekunden, 72 °C für 1 Minute) für 30 Zyklen; 72 °C für 10 Min.; 4 °C bis ins Unendliche.

Die KPR-Maus-Pankreas-Adenokarzinom-Zelllinie wurde von der Junttila-Gruppe bei Genentech aus KPR-PDAC-GEMMs (KrasLSL.G12D/wt;p16/p19fl/wt;p53LSL.R270H/wt;Pdx1.Cre)11 generiert. KPR-Zellen wurden in RPMI mit 10 % FBS (Hyclone) plus 2 mmol l–1 l-Glutamin kultiviert. Alle Zelllinien wurden mittels quantitativer PCR (Lonza Mycoalert und Stratagene Mycosensor) auf Mykoplasmenkontamination getestet. Bei allen injizierten Tumoren wurden Zellen innerhalb der ersten drei Passagen verwendet.

Bei subkutanen KPR-Tumoren wurden KPR-Zellen trypsinisiert, filtriert, gezählt und in einer 1:1-Mischung aus gepufferter Hanks-Kochsalzlösung und phenolrotfreiem Matrigel (Corning) in einer Konzentration von 1 × 106 Zellen ml–1 resuspendiert. Für alle verwendeten Mäusegenotypen wurden alters- und geschlechtsangepasste 6–12 Wochen alte Mäuse subkutan in die rechte einseitige Flanke mit 1 × 105 KPR-Tumorzellen geimpft. Die Flankenhaare wurden vor der Implantation rasiert. Das Tumorvolumen wurde 2–3 Mal pro Woche gemessen und unter Verwendung der folgenden modifizierten Ellipsoidformel berechnet: ½ × (Länge × Breite2). Tumoren > 1.000 mm3 galten als fortgeschritten und die Tiere wurden aus der Studie entfernt. Ebenso wurden Tiere aus der Studie ausgeschlossen, bei denen die Tumore mehr als 5 mm ulzerierten. Bei subkutanen Tumorstudien an Lrrc15DTRGFP-Mäusen wurden die Tiere, wenn die Tumore ein Volumen von 100–200 mm3 erreichten (etwa 10 Tage nach der Inokulation), auf der Grundlage des Tumorvolumens in Behandlungsgruppen eingeteilt und mit der Behandlung begonnen.

Bei orthotopen Pankreas-KPR-Tumoren wurde die Injektion von Pankreastumorzellen in die Bauchspeicheldrüse von Mäusen wie zuvor beschrieben durchgeführt29. KPR-Zellen wurden in einer 1:1-Mischung aus gepufferter Hanks-Kochsalzlösung und phenolrotfreiem Matrigel (Corning) in einer Konzentration von entweder 2 × 105 oder 2 × 106 Zellen ml–1 resuspendiert. DptCreERT2Tgfbr2fl/fl- oder Lrrc15DTR-Mäuse wurden mittels Inhalationsanästhesie anästhesiert, auf ein Heizkissen gelegt und mit Augentropfengel behandelt. Die linke Flanke oder der Bauchbereich wurde rasiert und mit ChloraPrep (BD) sterilisiert, bevor mit einer sterilen Mikroschere medial der Milzsilhouette ein etwa 1 cm langer Einschnitt vorgenommen wurde. Die darunter liegende Muskelschicht wurde eingeschnitten, und eine stumpfe Pinzette wurde verwendet, um die Bauchspeicheldrüse und die Milz nach außen zu legen. Eine vorbereitete 31-Gauge-Nadel mit der Zelllösung wurde in den Schwanz der Bauchspeicheldrüse eingeführt und 50 µl einer Lösung mit 1 × 105 Zellen wurden langsam injiziert. Die Wunde wurde mit resorbierbarem Nahtmaterial und Wundklammern verschlossen und man ließ die Mäuse sich erholen. Allen Tieren wurde das langsam freisetzende Analgetikum Buprenorphin SR LAB in einer Menge von 0,5 mg kg–1 verabreicht. Die Mäuse wurden jeden Tag nach dem chirurgischen Eingriff auf Anzeichen einer Infektion oder eines Leidens überwacht. Für orthotope Tumorstudien an Lrrc15DTRGFP-Mäusen wurden die Tiere 7 Tage nach der Implantation auf der Grundlage des Tumorvolumens in Behandlungsgruppen eingeteilt und die Behandlung wurde eingeleitet.

Die Mäuse wurden zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Behandlung zur Analyse gesammelt oder für Tumorwachstumsstudien verwendet. Die Probengrößen in den Mausstudien basierten auf der Anzahl der Mäuse, die routinemäßig benötigt wurden, um eine statistische Signifikanz basierend auf der Variabilität innerhalb der Studiengruppen zu ermitteln. Die Behandlungsgruppen wurden nach Möglichkeit verblindet. Alle hierin enthaltenen Tierstudien wurden vom Genentech Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

Für orthotope Pankreastumorstudien an Lrrc15DTRGFP-Mäusen wurden die Tumorvolumina mittels Ultraschallbildgebung gemessen. Die Mäuse wurden mit 4 % Sevofluran (Zoetis) in einer warmen Induktionsbox anästhesiert und während der Bildgebung auf der rechten Seite unter einem kontinuierlichen Fluss von 2,5–3 % Sevofluran positioniert. Nach der Haarentfernung wurde Ultraschall-Kopplungsgel auf die Haut aufgetragen und anatomische B-Mode-Bilder wurden auf dem Vevo2100 (Fujifilm VisualSonics-) in Quer- und Längsebene aufgenommen, wobei die maximalen Tumorquerschnitte erfasst wurden (MS-550D-Sonde; Mittenfrequenz von 40 MHz, axiale Auflösung 40 µm, laterale Auflösung 90 µm und Feldtiefe 12 mm). Das Pankreastumorvolumen pro Maus wurde mit Vevo LAB v.5.5.1 mit der folgenden Formel für ein Ellipsoid analysiert: Volumen (mm3) = π/6 × Länge × Breite × Tiefe.

Für die TAM-induzierte Cre-Expression wurden Mäusen an fünf aufeinanderfolgenden Tagen 2 mg TAM (Sigma, T5648), verdünnt in Sonnenblumenkernöl (Sigma, 88921), intraperitoneal injiziert oder sie erhielten TAM-haltiges Futter (Envigo, TD.130859). Für die LRRC15-CAF-Ablation wurden Mäusen zweimal pro Woche 25 ng g–1 DT (Enzo Life Sciences, BML-G135) intraperitoneal injiziert. Für CD8-Depletionsstudien wurden Mäuse entweder mit Ratten-IgG2b-Isotyp-Kontrollantikörpern oder mit Ratten-Anti-CD8-IgG2b-depletierenden Antikörpern (BioXcell, BE0061) in einer Dosis von 10 mg kg–1 behandelt, die dreimal pro Woche intraperitoneal verabreicht wurde. Für Anti-PDL1-Studien wurden Mäuse mit Isotyp-Kontrollantikörpern oder Anti-PDL1 (6E11)-Antikörpern (hausintern) behandelt. Die erste Dosis betrug 10 mg kg–1, gefolgt von 5 mg kg–1 und wurde anschließend zweimal pro Woche intraperitoneal verabreicht.

Die Tumoren wurden gesammelt, gewogen und in kleine Stücke zerkleinert. Um naive Flankenhaut zu isolieren, wurden Haare rasiert, Fettgewebe entfernt und Hautgewebe zerkleinert. Anschließend wurden alle Gewebe mit einem Cocktail aus Dispase (Life Technologies), Kollagenase P und DNaseI (Roche) 45 Minuten lang bei 37 °C enzymatisch verdaut, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Zellen wurden mit einem Vi-CELL XR (Beckman Coulter) gezählt. Zur Zytokinfärbung wurden Zellsuspensionen mit eBioscience Cell Stimulation Cocktail plus Proteintransportinhibitoren (00-4975-93) stimuliert, resuspendiert in RPMI mit 10 % FBS plus 2 mmol l–1 l-Glutamin und 2-Mercaptoethanol für 2 Stunden bei 37 °C C. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Zellen mit den folgenden monoklonalen Antikörpern von BioLegend oder BD Biosciences bei 4 °C auf Eis für 20–30 Minuten markiert. Vor der Färbung der Zelloberfläche mit den folgenden fluoreszierend markierten Antikörpern wurden die Zellen mit Fc-Block (2.4G2; 1:200, 553142) blockiert. Die folgenden Oberflächen- oder intrazellulären Antikörper wurden verwendet: CD45 (30-F11, 103139); EPCAM (G8.8, 118218); CD31 (390, 561410); PDPN (8.1.1, 127410); CD24 (M1/69, 612832); LRRC15 (M25, intern); CD90.2 (53-2.1, 565527); CD8 (53-6,7, 612759); PD1 (29F.1A12, 135225); TIM3 (RMT3-23, 119727); LAG3 (C9B7W, 125227); CD39 (Duha59, 143812); IFNγ (XMG1.2, 505846); Granzym B (GB11, 515408); und TNF (MP6-XT22, 506324). Lebende Zellen wurden durch Inkubation mit Calceinblau (Invitrogen, C1429, 1:1.000) nach Oberflächenfärbung identifiziert. Für die intrazelluläre Färbung wurden die Proben mit einem BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit (554714) gemäß den Anweisungen des Herstellers fixiert, permeabilisiert und gefärbt. Die Daten wurden mit einem Fortessa-, Symphony- oder LSRII-Durchflusszytometer (BD Biosciences) erfasst und mit FlowJo (Tree Star, v.10.7.1) analysiert, oder die Zellen wurden mit einem Fusion oder Aria (BD Biosciences) sortiert. Die Instrumentendaten wurden mit Prism GraphPad verarbeitet. Weitere Informationen finden Sie in der Ergänzungstabelle 6.

Zur Stimulation mit plattengebundenem Anti-CD3 wurden Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen über Nacht bei 4 °C mit 10 µg ml–1 Anti-CD3 (BioLegend, 100340, Klon 145-2C11) beschichtet und einmal mit PBS gewaschen. Relevante primäre CAFs wurden aus verdauten subkutanen KPR-Tumoren von DTR- oder DTR+-Mäusen sortiert und dann 3 × 104 Zellen in die mit Anti-CD3 beschichtete Vertiefung gegeben (100 µl). Die Zellen wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, um die Anlagerung zu erleichtern. Während der Inkubation wurden Maus-CD8+-T-Zellen aus einer Einzelzellsuspension naiver Splenozyten durch immunomagnetische Negativselektion unter Verwendung eines EasySep Mouse CD8+-T-Zell-Anreicherungskits von Stem Cell (19853) gemäß den Richtlinien des Herstellers isoliert. Etwa 6 × 104 gereinigte CD8+ T-Zellen wurden in Gegenwart von löslichem 0,50 µg ml–1 Anti-CD28 (BioLegend, 102115, Klon 37.51) (100 µl) in die Vertiefungen gegeben. Am Tag der Analyse wurde das Medium ersetzt und die Zellen wurden mit 1× Zellstimulationscocktail (eBioscience 500× Zellstimulationscocktail plus Proteintransportinhibitoren, 00-4975) und 55 µM 2-Mercaptoethanol 4 Stunden lang bei 37 °C kultiviert. Die Zellen wurden gesammelt, gefiltert und auf Oberflächenmarker gefärbt. Nach der Oberflächenfärbung wurden die Zellen mit dem intrazellulären Fixierungs- und Permeabilisierungspuffersatz gemäß den Richtlinien des Herstellers fixiert und permeabilisiert, bevor sie auf intrazelluläre Zytokine gefärbt wurden. Die Zellen wurden dann mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Die Tumoren wurden über Nacht in 4% Paraformaldehyd fixiert und in ein Medium mit optimaler Schnitttemperatur (Sakura Finetek) eingebettet und zur Lagerung bei –80 ° C eingefroren. Schnitte (8–12 μm dick) wurden kryogeschnitten und gefärbt. Zur Färbung wurden die Objektträger mit normalem Mausserum (1:50), Maus-Fc-Block (1:100) und 0,3 % Triton-X, verdünnt in PBS, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert und permeabilisiert. Gewebeschnitte wurden mit primären Antikörpern 1 Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur sekundäre Antikörper zugegeben. Zur Gegenfärbung wurden die Objektträger gespült und mit DAPI (ThermoFisher, D1306) bei 300 nM in PBS 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Einzelheiten zu den verwendeten Antikörpern finden Sie in der Ergänzungstabelle 6. Die Objektträger wurden mehrmals in PBS gespült, überschüssiger Puffer abgelassen und die Schnitte in Vectashield (H-1000) montiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Nikon A1R-Mikroskop aufgenommen, das mit einem Plan-Apo-Lambda-NA-0,75-×20-Objektiv ausgestattet war. Die Laser wurden auf eine Anregung bei 488 nm, 561 nm und 640 nm sowie auf ein perfektes Fokusmodul eingestellt. Die Erfassungssoftware NIS Elements wurde mit einem Digitalzoom von 2 für die Abbildung vollständiger Gewebeschnitte oder 7 für Details verwendet und es wurde eine Zusammenfügung von Einzelebenenbildern durchgeführt. Es wurden Schätzungen der CD8-T-Zell-LRRC15-CAF-Interaktionsraten zwischen T-Zellen und CAFs zusammengestellt, die bei der Gesamtzahl der T-Zellen in einem 500 × 500 × 10 µm3 großen Gewebeabschnitt bei drei verschiedenen Tumoren beobachtet wurden.

Gewebe für die In-situ-Hybridisierung wurden formalinfixiert und in Paraffin eingebettet. Die In-situ-Hybridisierung von Maus-LRRC15 wurde unter Verwendung einer ACD-Sonde (Advanced Cell Diagnostics, 467838) mit 120-minütiger Hybridisierung durchgeführt. ER2-Retrieval (Leica) bei 95 °C für 15 Minuten und RNAscope 2.5 LS Protease III-Verdau (ACD) wurden auf einem Leica Bond durchgeführt Autostainer. Zur Detektion wurde RNAscope 2.5 LS Reagent Kit Red (ACD) verwendet.

Maus-scRNA-seq und Zell-Hashing mit einzigartigen Barcode-Antikörpern (BioLegend) wurden unter Verwendung der Chromium Single Cell Gene Expression 3′ v3 Library und eines Gel Bead Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (10x Genomics, PN-1000075) verarbeitet. Die Zellen wurden mit einem Vi-CELL XR-Zellzähler (Beckman Coulter) gezählt und auf Lebensfähigkeit überprüft und dann in Mikrofluidik-Chips injiziert, um in einem 10x-Chrom-Instrument Gelkügelchen in Emulsion zu bilden. An den Gelkügelchen in Emulsion wurde eine reverse Transkription durchgeführt und die Produkte wurden gereinigt und amplifiziert. DNA von Antikörper-abgeleiteten Tags wurde von cDNA basierend auf der Größenauswahl unter Verwendung von SPRIselect-Kügelchen (Beckman Coulter, B23318) getrennt. Expressionsbibliotheken und von Antikörpern abgeleitete Tag-Bibliotheken wurden mit einem Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, 5067-4626) erstellt und profiliert und mit einem Kapa Library Quantification Kit (Roche, 07960255001) quantifiziert. Alle Bibliotheken wurden mit HiSeq4000 und NovaSeq (Illumina) sequenziert.

scRNA-seq-Daten für jede Bibliothek aus jedem Zelltyp wurden mit CellRanger-Zählung (CellRanger 3.1, 10x Genomics) mit einer benutzerdefinierten Referenz basierend auf dem Maus-Referenzgenom GRCm38 und den GENCODE-Genmodellen verarbeitet. Die Anzahl der Barcode-Antikörper zur Markierung einzelner Replikate wurde mit DemuxEM mit Standardparametern zur Zuweisung einzelner Probenetiketten verarbeitet30. Zellen, die als Dubletts oder HTO-negative Zellen identifiziert wurden, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Zur Zählung der Genexpression wurden einzelne Proben zu einer Expressionsmatrix zusammengeführt und mit dem Paket Seurat analysiert. Zellen mit weniger als 300 exprimierten Genen oder mehr als 5 % Mitochondrienzahl wurden entfernt. Die Transkriptzahlen wurden logarithmisch normalisiert (Seurat, NormalizeData), und die 2.000 variabelsten Gene wurden mithilfe einer varianzstabilisierenden Transformation (FindVariableFeatures) und anschließender Datenskalierung (ScaleData) ausgewählt. Anschließend wurde PCA an diesem Genraum durchgeführt (RunPCA). Das Clustering wurde auf der Grundlage des gemeinsamen nächsten Nachbarn zwischen Zellen (FindNeighbors, 30 PCs) und des graphbasierten Clusterings (30 PCs, Auflösung von 0,1 für Lrrc15-Depletion, 0,5 für Tgfbr2-KO-Experimente) durchgeführt. Wir haben Marker für einzelne Cluster mithilfe der FindMarkers-Funktion in Seurat berechnet (Wilcoxons Rangsummentest, Benjamini-Hochberg-Anpassung für Mehrfachtests). Um die Genexpressionsniveaus für einzelne Cluster zu visualisieren, haben wir die durchschnittliche Genexpression in jedem Cluster berechnet und einen Z-Score-Wert für jedes Gen berechnet.

Für die DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl-Experimente wurden Zellen im resultierenden Seurat-Objekt aus dem ersten Datenverarbeitungsschritt basierend auf der Expression bekannter Zelltyp-Marker weiter gefiltert. Für nachfolgende Analysen wurden nur Fibroblastenzellen aus den Clustern 0, 2, 3, 4, 5 und 8 zurückbehalten, die Lum und Dcn exprimieren, nicht jedoch Pecam1 (Endothelzellen), Ptprc (Immunzellen) oder Rgs5 (Perizyten). Anschließend führten wir wie oben beschrieben eine Dimensionsreduktion und Clusterbildung durch und entfernten verbleibende geringfügig kontaminierende Nicht-Fibroblastenzellen. Die endgültige Dimensionsreduktion und das Clustering wurden mit 30 PCs und einer Clustering-Auflösung von 0,3 durchgeführt.

Für die Lrrc15DTRGFP-Depletionsexperimente wurden Fibroblastenzellen (Cluster 0, 1, 2 und 5) im resultierenden Seurat-Objekt aus dem ersten Datenverarbeitungsschritt isoliert, indem Cluster ausgeschlossen wurden, die Pecam1 (Endothelzellen), Ptprc (Immunzellen), Rgs5 ( Perizyten), Krt18 (Epithel) oder Myl1 (glatte Muskelzellen). Anschließend führten wir wie oben beschrieben eine Dimensionsreduktion und Clusterbildung durch und entfernten verbleibende geringfügig kontaminierende Nicht-Fibroblastenzellen. Die endgültige Dimensionsreduktion und das Clustering wurden mit 30 PCs und einer Clustering-Auflösung von 0,2 durchgeführt.

Die Zellen wurden für Genexpressionsprogramme unter Verwendung der addModuleScore-Funktion in Seurat und eines interessierenden Gensatzes als Eingabe bewertet. PDAC-Maus-GEMM-Programme wurden wie folgt abgeleitet. Wir haben Gene mit einer durchschnittlichen logarithmischen Fold-Change-Hochregulation von mindestens 0,6 in TGFβ-CAFs (Cluster 2) aus unserer vorherigen Studie1 als Markergene für diese Erkrankungen verwendet. Um einen Gensatz für normale Gewebefibroblasten (Cluster 3 und 4) zu identifizieren, haben wir die Top-20-Marker für die Cluster 3 und 4 identifiziert und diese mit allen anderen Zellen im Datensatz mithilfe der FindMarkers-Funktion in Seurat verglichen.

Um Unterschiede in der Häufigkeit von Zellen aus bestimmten Clustern zwischen Bedingungen zu bewerten, haben wir das R-Paket Speckle (https://github.com/Oshlack/speckle) verwendet, mit dem signifikante Unterschiede in den Zelltypanteilen ermittelt werden können. Kurz gesagt berechnet Speckle den Anteil der Zellen, die einem bestimmten Cluster in jedem biologischen Replikat zugeordnet sind, führt eine varianzstabilisierende Transformation der Anteile durch und bestimmt, ob die Zelltypanteile zwischen verschiedenen Gruppen signifikant sind. Da wir in allen unseren Experimenten nur zwei Gruppen verglichen haben, wurde der t-Test von Speckle verwendet, um P-Werte zu berechnen, die für mehrere Tests mithilfe der Benjamini-Hochberg-Korrektur angepasst wurden.

Wir haben PROGENy17 verwendet, um die Pathway-Aktivität aus unseren Einzelzell-Genexpressionsdaten abzuleiten, wie zuvor beschrieben10 und dem von den Autoren bereitgestellten Einzelzell-Tutorial gefolgt (https://saezlab.github.io/progeny/articles/ProgenySingleCell.html). Wir haben die Nachkommenswerte entweder mit Clustern oder mit dem Zeitpunkt/Zustand des Experiments abgeglichen und die Daten nach Population zusammengefasst.

Normalisierte Fragmente pro Kilobase Sequenz pro Million kartierter Lesewerte wurden aus der Ergänzungstabelle 6 in Lit. abgerufen. 12. Die Daten wurden logarithmisch transformiert und die Expressionsniveaus von Lrrc15 und Gapdh wurden durch Gewebe sichtbar gemacht.

Chargenkorrigierte normalisierte TCGA-Pan-Cancer-mRNA-Daten wurden von UCSC Xenabrowser (https://xenabrowser.net/) erhalten (N = 11.060). Proben mit NA-Ausdruckswerten wurden entfernt. Wir haben die Daten zusätzlich so gefiltert, dass sie nur Proben von primären soliden Tumoren enthalten (Probencode 01; N = 9.702). Überlebensdaten wurden aus Tabelle S1 in Lit. erhalten. 31 und mithilfe des eindeutigen TCGA-Teilnehmerbarcodes mit dem Pan-Cancer-Datensatz verknüpft. Indikationen mit weniger als 80 Patienten wurden von der Analyse ausgeschlossen (endgültiger Datensatz: N = 9.195 Patienten). Die TGFB-CAF-Spiegel wurden abgeleitet, indem die durchschnittliche Expression unserer zuvor veröffentlichten Markersignatur1 innerhalb einer Probe nach der Z-Score-Transformation jedes Gens über die Proben hinweg berechnet wurde. Der Zusammenhang mit dem Überleben über TCGA-Daten hinweg wurde mit multivariater Cox-Regression und TCGA-Indikation als Kovariate sowie einer univariaten Cox-Regressionsanalyse innerhalb jeder Indikation bestimmt. Die Hazard Ratio wurde als Veränderung des Sterberisikos definiert, wenn der TGFβ-CAF-Score um eine Einheit anstieg.

Für die Immunprofiler-Initiative (IPI) wurden Tumorproben aus verschiedenen Krebs-Operationssälen und aus Ambulanzen transportiert. Alle Patienten erteilten der IPI-Klinikkoordinatorgruppe der University of California, San Francisco (UCSF) ihr Einverständnis zur Gewebeentnahme gemäß einem vom Institutional Review Board (UCSF IRB 20-31740) genehmigten UCSF-Protokoll. Die Proben wurden nach chirurgischer Entfernung entnommen und von Pathologieassistenten Biopsien entnommen, um das Vorhandensein von Tumorzellen zu bestätigen. Die Auswahl der Patienten erfolgte ohne Rücksicht auf die vorherige Behandlung. Frisch resezierte Proben wurden in eiskaltes PBS- oder Leibovitz-L-15-Medium in einem konischen 50-ml-Röhrchen gegeben und sofort zur Probenkennzeichnung und -verarbeitung ins Labor transportiert. Die Proben wurden entweder für den Aufschluss des gesamten Gewebes zu einer Einzelzellsuspension verwendet oder ein Teil des Gewebes wurde in Scheiben geschnitten und für die bildgebende Analyse konserviert.

Zellsortierung, Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und bioinformatische Datenverarbeitung wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt32.

Aus der logarithmisch transformierten Matrix normalisierter Genexzellexpressionswerte identifizierten wir die 2.500 variabelsten Gene anhand ihres Interquartilbereichs und führten eine PCA im Raum dieser Gene durch. Anschließend verwendeten wir die 10 am stärksten positiv und negativ geladenen Gene von PC1–PC6 für die hierarchische Clusterung von Proben und Genen (vollständige Verknüpfung und euklidischer Abstand). Das Cluster-Dendrogramm wurde basierend auf der Baumhöhe in k = 6 Cluster aufgeteilt. Wir interpretierten Probencluster mit hoher Expression von EPCAM, KRT8 und KRT18 als epithelgetrieben und TYROBP und CSF3R als myeloidgetrieben und schlossen diese Proben aus unserer nachfolgenden Analyse aus. Als nächstes führten wir eine PCA mit den verbleibenden Proben durch. Die Ladungen des resultierenden PC-Raums wurden dann verwendet, um die epithelialen und myeloischen Proben auf PC1 und PC2 zu projizieren. In ähnlicher Weise wurden mikrodissezierte Massen-RNA-seq-Proben von Patienten mit PDAC, wie in Lit. bereitgestellt. 33 wurden aus der Gene Expression Omnibus-Datenbank (Kennung GSE93326) bezogen und auf PC1 und PC2 projiziert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Rohe und verarbeitete scRNA-seq-Datensätze sind im ArrayExpress-Repository unter den Zugangsnummern E-MTAB-12028 und E-MTAB-12036 verfügbar. Massen-RNA-seq-Daten menschlicher Stromazellen sind in der Datenbank des Europäischen Genom-Phänomen-Archivs unter der Zugangsnummer EGAD00001009176 verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Für dieses Manuskript wurden keine neuen Algorithmen entwickelt. Der gesamte für die Analyse generierte Code ist auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.

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Wir danken den Mitgliedern des Turley-Labors für Diskussionen und experimentelle Unterstützung sowie dem Einrichtungspersonal von Genentech für die Wartung des Vivariums und die Unterstützung der Kernanlage. Die in dieser Studie beschriebene Erfassung und Analyse bestimmter menschlicher Proben wurde von der UCSF durchgeführt und teilweise durch Beiträge von AbbVie, Amgen, Bristol-Myers Squibb, Genentech und Pfizer im Rahmen des UCSF IPI finanziert. Maus-, Menschen- und Zellillustrationen wurden mit BioRender.com erstellt. Diese Arbeit wurde von Genentech unterstützt.

Genentech, South San Francisco, CA, USA

Akshay T. Krishnamurty, Justin A. Shyer, Minh Thai, Vineela Gandham, Matthew B. Buechler, Yeqing Angela Yang, Rachana N. Pradhan, Amber W. Wang, Patricia L. Sanchez, Yan Qu, Beatrice Breart, Cécile Chalouni, Debra Dunlap, James Ziai, Justin Elstrott, Neelie Zacharias, Weiguang Mao, Rebecca K. Rowntree, Jack Sadowsky, Gail D. Lewis, Thomas H. Pillow, Barzin Y. Nabet, Romain Banchereau, Lucinda Tam, Roger Caothien, Natasha Bacarro, Merone Roose-Girma, Zora Modrusan, Sanjeev Mariathasan, Sören Müller und Shannon J. Turley

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Konzeptualisierung: ATK, S. Müller. und SJT-Methodik: ATK, S. Müller. und SJT Software, formale Analyse und Datenkuration: AWW und S. Müller. Untersuchung: ATK, JAS, MT, VG, MBB, YAY, RNP, PLS, YQ, BB, CC, DD, JZ, JE, NZ, WM, RKR, JS, GDL, THP, BYN, RB, LT, RC, NB, MR-G., ZM und S. Mariathasan. Text: ATK, S. Müller. und SJT-Visualisierung: ATK, MT, CC, RNP, JZ und S. Müller. Betreuung: S. Müller. und SJT

Korrespondenz mit Sören Müller oder Shannon J. Turley.

Alle Autoren sind Mitarbeiter von Genentech Inc., einem Mitglied der Roche-Gruppe.

Nature dankt Mara Sherman und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

A. Aus subkutanen KPR-Tumoren 21 Tage nach der Implantation in Dptwt/wtRosa26LSLYFP+/- und Dptki/kiRosa26LSLYFP+/- Mäusen mit repräsentativen Durchflusszytometriediagrammen (links) und Quantifizierung der Häufigkeit (rechts) von Dpt-YFP+-Zellen in PDPN+CD31–-Fibroblasten (n = 6 Mäuse). Bi. Aus subkutanen KPR-Tumoren 21 Tage nach der Implantation in Dptwt/wtTgfbr2fl/fl- und Dptki/kiTgfbr2fl/fl-Mäusen nach dem experimentellen Schema aus Abb. 1a, das b zeigt. Repräsentatives Durchflusszytometrie-Histogramm (links) und Quantifizierung der Häufigkeit (rechts) von TGFβR2+-Zellen in PDPN+CD31–-Fibroblasten (n = 10 Mäuse). C. Repräsentative Gating-Strategie vor der Sortierung (links) und Reinheitsanalyse nach der Sortierung (rechts) von CD24-CD45-Stromazellen und CD45+-Immunzellen d. UMAP-Diagramm von 10.136 Stroma- und Immunzellen, gefärbt nach Clusterzugehörigkeit (links), Markergenexpression (Mitte) und Häufigkeit einzelner Zell-Hash-Proben in Clustern von UMAP (n = 5 Mäuse pro Gruppe). e. Violindiagramme, die die Punktzahl für eine Tgfb-CAF-PDAC-GEMM-Gensignatur für Zellen in jedem Cluster aus Abb. 1e zeigen. f,g. UMAPs wie in Abb. 1f, gefärbt durch Expression der angegebenen Marker. H. Anteil der Zellen in jedem Cluster aus jeder Bedingung aus Abb. 1e (n = 5 Tiere pro Bedingung). ich. Werte für denselben Gensatz wie in e, hier für Zellen im proliferierenden Cluster (C4) aus Abb. 1e und aufgeteilt nach Bedingung. Die Daten in a,b werden aus zwei oder drei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Die Daten in a,b sind Mittelwert +/− Standardabweichung und in h sind Mittelwert + Standardabweichung. Die Statistiken in a,b,h wurden mithilfe eines zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests berechnet.

Quelldaten

A. Strategie für die Analyse sortierter CAF-Populationen aus menschlichen Tumoren: Links: PCA wurde an allen Proben durchgeführt und die 20 stärksten positiven und negativsten Ladegene aus jedem PC wurden extrahiert. Mitte: Hierarchisches Clustering wurde durchgeführt und Proben ohne jegliche Kontamination wurden isoliert. Rechts: PCA wurde an diesen reinen Proben durchgeführt. Proben mit einigen Verunreinigungen wurden in diesen PCA-Raum projiziert, der aus reinen Proben gewonnen wurde, um Abb. 1l abzuleiten. B. Verteilung von normalem angrenzendem (N) und Tumorgewebe (T) entlang PC1 aus Abb. 1l. C. Projektion von 123 mikrodissezierten PDAC-RNA-seq-Proben in den in Abb. 1b erhaltenen PCA-Raum. D. Gleiches Waldgrundstück wie in Abb. 1p, hier für alle Krebsindikationen in TCGA. In den Daten in b,c stellen Whiskers das Minimum und Maximum dar, das Kästchen stellt den IQR dar und die Mittellinie stellt den Median dar. In den Daten in d zeigt der Mittelpunkt die Gefährdungsquote und die Linien stellen das 95 %-Konfidenzintervall dar. Die Statistiken wurden unter Verwendung eines Cox-Proportional-Hazards-Regressionsmodells in d berechnet.

Quelldaten

A. Quantifizierung der Häufigkeit von LRRC15+-Zellen in subkutanen KPR-Tumoren 17 Tage nach der Implantation in PDPN+-Fibroblasten, CD31+-Blutendothelzellen (BEC), PDPN-CD31–-Stromazellen, CD45+-Immunzellen und CD24+-Tumorzellen (n = 10 Mäuse). B. Repräsentative LRRC15-In-situ-Hybridisierungsbilder ausgewählter gesunder Mausgewebe und subkutanen KPR-Tumorgewebes 17 Tage nach der Implantation. C. Massen-RNAseq-Daten von 17 normalen Mausgeweben, die die Expression von Lrrc15 und Gapdh (Kontrolle) zeigen. Die Anzahl der Proben pro Gewebe ist in den Quelldaten enthalten. df. Fap-, Acta2- und Lrrc15-Genexpression von d. scRNAseq-Analyse von Fibroblasten, Immunzellen, Endothelzellen und Perizyten von KPR-Tumoren 21 Tage nach der Implantation in Dptwt/wtTgfbr2fl/fl-Mäusen. e. scRNAseq von Pdgfrα+-Steady-State-Fibroblasten in murinen Geweben. F. scRNAseq von Fibroblasten und Perizyten aus naiven hautdrainierenden Lymphknoten der Maus zusammen mit der Ccl19-Expression. Die Daten in a werden aus drei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Die Daten in b sind repräsentativ für ein unabhängiges Experiment. Die Daten in a sind Mittelwerte +/− sd. Bei den Daten in c stellen Whiskers das Minimum und Maximum dar, das Kästchen stellt den IQR dar und die Mittellinie stellt den Median dar. Die Statistiken in a wurden mithilfe eines gewöhnlichen einfaktoriellen ANOVA-Tests berechnet.

Quelldaten

a,b. Von subkutanen KPR-Tumoren 8 Tage nach PBS- oder DT-Behandlung bei DTR– und DTR+ Mäusen. A. Repräsentative Durchflusszytometriediagramme, die die Häufigkeit von LRRC15+-Zellen in PDPN+CD31–-Fibroblasten und b zeigen. Quantifizierung der Gesamtzahl der PDPN+LRRC15+-Zellen normalisiert durch das Tumorgewicht (n = 6 Mäuse) c. Quantifizierung der Häufigkeit von PDPN+LRRC15+-Zellen (links) und PDPN+CD31–-Fibroblasten (rechts) an den Tagen 7 (n = 8 oder 9 Mäuse), 14 (n = 10 Mäuse) und 21 (n = 10 Mäuse) nach DT Behandlung bei subkutanen KPR-Tumoren, die DTR– und DTR+-Mäuse tragen. D. Kurven zur Veränderung des Körpergewichts von DTR–- und DTR+-Mäusen, die mit DT behandelt wurden (n = 9 oder 11 Mäuse/Gruppe). Durchschnittliche Körpergewichtsveränderung aller Tiere (links); Individuelle Körpergewichtsveränderungskurven pro Genotyp (rechts). Die X-Achse stellt die Tage nach der DT-Behandlung dar. Die Daten in b,c werden aus zwei oder drei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Die Daten in d sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Die Daten in b,c,d sind Mittelwerte +/− sd. Die Statistiken wurden unter Verwendung eines gewöhnlichen einfaktoriellen ANOVA-Tests in b und eines gewöhnlichen zweifaktoriellen ANOVA-Tests in c berechnet.

Quelldaten

A. Repräsentative Gating-Strategie vor der Sortierung (links) und Reinheitsanalyse nach der Sortierung (rechts) von Stromazellen aus subkutanem KPR-Tumorgewebe (oben) oder naivem Hautgewebe (unten). B. UMAP-Diagramm von 54.240 Stromazellen, gefärbt nach Clusterzugehörigkeit (links). UMAP wie links, hier gefärbt durch die angegebene Markergenexpression (Mitte) und Häufigkeit einzelner Zell-Hash-Proben in Clustern von UMAP (rechts). Relative durchschnittliche Expression der Top-5-Markergene in jedem Cluster (unten). C. UMAP (D0,7,14,21; links, D7,14,21; rechts) wie in 3b, aufgeteilt, gefärbt durch die Expression von Cxcl12. D. Anteil der Zellen in C1, C2 und C5 aus Abb. 3b in jedem Zustand (n = 5 Tiere/Zustand) zu allen vier Zeitpunkten in tumortragenden Proben. e. Violindiagramme, die die Punktzahl für eine C3/C4-Gensignatur der naiven Haut für Zellen aus jedem Cluster in Abb. 3b zeigen. F. Anreicherungswerte des PROGENY-Signalwegs (Farbe) für Zellen, die für jeden Cluster in Abb. 3b gepoolt wurden. Die Daten in d sind Mittelwert + Standardabweichung. Die Statistiken in d wurden mithilfe eines zweiseitigen, ungepaarten Student-T-Tests berechnet.

Quelldaten

A. Individuelle Tumorwachstumskurven von DT-behandelten subkutanen KPR-Tumoren tragenden DTR–- und DTR+-Mäusen in Kombination mit CD8-depletierendem Antikörper oder Isotypkontrolle (n = 10 Mäuse/Gruppe). Die gestrichelte rote Linie stellt die durchschnittliche Referenzanpassung der Kontrollgruppe dar (DTR– + Isotyp). B. Immunfluoreszenzanalyse von subkutanen KPR-Tumoren, die auf LRRC15 und CD8 gefärbt sind (links) und Quantifizierung der Häufigkeit von CD8+-T-Zellen in einem Abstand von weniger als 2 µm zu einem LRRC15+-CAF. CD. Experimentelles Schema (c) und Sortierstrategie (d) für das CAF-CD8+-T-Zell-Kokulturexperiment für Ergebnisse in 4f. e,f. Von DT-behandelten subkutanen KPR-Tumoren, die DTR– und DTR+-Mäuse in Kombination mit aPDL1-Antikörper oder Isotypkontrolle tragen, z. Zwei unabhängige Studien, die individuelle Tumorwachstumskurven zeigen (Studie 1: n = 9 oder 10 Mäuse/Gruppe; Studie 2: n = 9 oder 11 Mäuse/Gruppe). Die gestrichelte rote Linie stellt die durchschnittliche Referenzanpassung der Kontrollgruppe dar (DTR– + Isotyp). F. Überlebensanalyse der Zeit bis zum Fortschreiten eines Tumorvolumens von 1000 m3 oder einer Tumorgeschwürbildung von mehr als 5 mm (n = 9 oder 10 Mäuse/Gruppe). Die Daten in b sind Mittelwerte +/− Standardabweichung. Die Daten in a, f sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Die Statistiken in f wurden mithilfe eines Log-Rank-Mantel-Cox-Tests berechnet.

Quelldaten

a–e. Von DT-behandelten orthotopen Pankreas-KPR-Tumoren, die DTR– und DTR+-Mäuse in Kombination mit aPDL1-Antikörper oder Isotypkontrolle tragen a. Repräsentative Ultraschallbilder von Pankreas-KPR-Tumoren über alle Behandlungsgruppen und Zeitpunkte hinweg. Die gestrichelte blaue Linie markiert den Umfang des Tumors. B. Individuelle Tumorwachstumskurven (n = 7 Mäuse/Gruppe). Die gestrichelte rote Linie stellt die durchschnittliche Referenzanpassung der Kontrollgruppe dar (DTR– + Isotyp). C. Repräsentative Durchflusszytometriediagramme, die die Häufigkeit von LRRC15+-Zellen in PDPN+CD31–-Fibroblasten zeigen d,e. Quantifizierung der Gesamtzahl der PDPN+LRRC15+-Zellen (d) und PDPN+CD31+-Zellen (e), normalisiert durch das Tumorgewicht (n = 5 Mäuse). Die Daten in d,e sind Mittelwerte +/− sd. Die Daten in ae sind repräsentativ für ein unabhängiges Experiment. Die Statistiken in d,e wurden mithilfe eines gewöhnlichen einfaktoriellen ANOVA-Tests berechnet.

Quelldaten

Marker aller Zellen für das DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl scRNA-seq-Experiment.

Marker von Fibroblasten für das DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl scRNA-seq-Experiment.

Patienteninformationen für die IPI-Kohorte.

Marker für alle Zellen für das kinetische scRNA-seq-Experiment Lrrc15DTR.

Marker für Fibroblasten für das kinetische scRNA-seq-Experiment Lrrc15DTR.

Informationen zu den in diesem Manuskript verwendeten Antikörpern.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Krishnamurty, AT, Shyer, JA, Thai, M. et al. LRRC15+-Myofibroblasten bestimmen den Stroma-Sollwert zur Unterdrückung der Tumorimmunität. Natur 611, 148–154 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05272-1

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Eingegangen: 14. Juli 2021

Angenommen: 24. August 2022

Veröffentlicht: 28. September 2022

Ausgabedatum: 03. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05272-1

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